Archivos Mensuales: diciembre 2013

LA INTERPRETACION CLÍNICA DE LA” COLORACION DE GRAM”

Dr Rafael Tobías Blanco Vilariño.

Médico Microbiólogo Clínico.

Universidad de Carabobo- Valencia- Venezuela.

La experiencia acumulada  como docente e investigador en el campo de la microbiología clínica, me han inducido a realizar este somero resumen sobre esta invalorable técnica, motivado a que muchos estudiantes de ciencias de la salud y profesionales, desconocen realmente como es su interpretación y cual su aplicación en el campo infectológico  al lado del paciente; al ellos creer que solamente clasifica a los microbios en Gram positivos y Gram negativos de acuerdo a su afinidad por el Violeta de Genciana; cuando en la realidad, ella juega un muy importante papel en la conducta epidemiológica, terapéutica y del pronóstico del proceso séptico. Por ello, me inicio primeramente tratando de explicar su fundamento y, para ello, debo recordar algunos aspectos en la constitución molecular de la Pared de los Gram negativos con respecto a la de los Gram positivos, entendiendo el que en ambos grupos existe una macromolécula, llamada Mucocomplejo, responsable de la rigidez de la pared, que amen de darle la morfología al microorganismo de coco, bacilo, espirilo etc., es la que impide la lisis de la bacteria por estallido, ya que su citoplasma posee una presión atmosférica que oscila entre 2 a 5 atmósferas y la membrana bacteriana por si sola es incapaz de soportarla sin la presencia de la pared; por ello, cuando el antibiótico actúa lesionando la pared como los Beta-lactámicos, la bacteria muere por bacteriólisis; dicha pared está formada por el encadenamiento de moléculas de N-Acetil- Glucosamina (NAG) con moléculas de Ácido Acetil-Muramico (AAM), cadenas que están unidas por puentes polipeptidicos, la cual en los Gram negativos es rica en Lípidos (20%) por lo que es conocida como Glúcido-Lípido-Proteica  o Lipo-Poli-Sacaridica(LPS), la cual es antigénica y representa la temible Endotoxina, condicionante del temido Shoc Séptico Endotoxinico, entre los amino-ácidos que también la constituyen están la glycina, alanina, el ácido glutámico, la lisina y el ácido diaminopimelico. (ver figura 1 y2)

Fig:1

Fig Nº 2

(*) Penicilinas y cefalosporinas, actúan rompiendo el puente polipeptidico, condicionante de la bacteriólisis

En los Gram positivos, esta pared es mucho mas gruesa, muy pobre en lípidos (2%) y porta el ácido Teicoico el cual no existe en los Gram negativos, y es el que juega un gran papel en la fisiopatología del shock séptico a Gram positivos, el cual es muy similar al de los Gram negativos; solo que en los Gram positivos se suceden procesos abscedantes en diferentes vísceras: cerebro, páncreas, hígado, riñón etc; de allí su denominación de Proceso Séptico-piogénico.

En lo que respecta al fundamento de la GRAM POSITIVIDAD, por la técnica convencional del Gram, técnica ideada por el histólogo y microbiólogo Danés Christian Gram el año 1848, hoy día se explica debido a la presencia en la pared de los Gram positivos de una molécula proteica de Ribonucleato de Magnesio, cuyo control catiónico se debe al ácido Teicoico y esta molécula de Ribonucleato, actúa impidiendo que  el colorante Violeta de Genciana sea barrido con el lavado con el alcohol absoluto, debido a que la solución fijadora yodo-yodurada de lugol al actuar como mordiente fija fuertemente  al violeta en la pared de los gran positivos, por lo que quedan teñidos de azul, mientras que en los Gram negativos si es lavado, y al quedar el bacilo decolorado, tenemos que usar para poder verlo una coloración de contraste que es la fuscina, que les tiñe de rojo, por lo que les llamamos Gram negativos.

Coloración clásica de Gram:

1-fijar el frotis suavemente con calor  y cubrir con Violeta de genciana por 60 segundos.

2-Lavar con agua y cubrir con Lugol por 30 seg.

3-cubrir y lavar con alcohol absoluto hasta que este no arrastre mas colorante.

4-detener la decoloración lavando con agua y cubrir con fuscina por 30 seg.

5-lavar con agua, secar y ver por inmersión.

 Siempre he dicho a mis alumnos, el que para el Microbiólogo Clínico esta técnica es tan importante y valiosa para su orientación diagnóstica, como el bisturí para el cirujano.

Interpretación Clínica del Gram:

1-     Para el Microbiólogo: le permite ver el morfotipo presente en el material séptico tomado del paciente: coco, bacilo, vibrio, espirilo, bacilo y su coloración Gram positiva o Gram negativa; nos permite saber si el proceso es monomicrobiano o mixto, la tendencia al pleomorfismo bacteriano o a su tendencia a la coloración bipolar(bacilo dela peste), todos estos elementos nos permiten seleccionar el medio de cultivo a emplear: agar nutritivo, agar sangre etc y el empleo de métodos para aeróbicos o anaeróbicos y obviamente el seleccionar los antimicrobianos de acuerdo a su afinidad por el Gram y de si el proceso es monomicrobiano o mixto (ver técnicas  del Antibiograma Bi-direccional y de la Asociación de antibióticos en medio líquido para seleccionar los sinérgicos y descartar los antagónicos)

2-     Para el Clínico terapeuta:Mientras logramos identificar al agente etiológico y demostrar su sensibilidad a los antimicrobianos, el Gram le permite seleccionar antibióticos Bactericidas para Gram Positivos o Gran negativos si es un proceso monomicrobiano, el usar antibióticos de amplio espectro  si es polimicrobiano o el usar asociaciones conocidas de antibióticos que actúen como sinérgicos y no como antagónicos.

3-      Creo importante recordar, el que cuando no logramos evidenciar morfologías microbianas, el que se deben hacer evaluaciones con otras técnicas tintoriales y microbiológicas para Clamidias,Virus, Hongos, Treponemas, bacilo tuberculoso etc.

CONCLUSION:  El Gram es una técnica de invalorable apoyo informático, cuando se efectúa correctamente y se evalúa con ojo avizor para beneficio nuestro y del paciente.

a-Nuevo Tests para la evaluación in-vitro de la asociación de antibióticos: Dr R T Blanco Vilariño y A. Celis Blaubach. Revista LABORATORIO. Nº 305, Año XXVI,Tomo LI, pág 407-416. Barcelona .España Mayo 1971

b-Antibiogramme bidirectionnel: nouvelle alternative dans les infections bactériennes mixtes. Dr R T Blanco Vilariño. Rev de la AAEIP Del Institut Pasteur. Vol.46, pág 93-95 Nº 179 Francia –Juin 2004

Valencia: 29-11-2013